La recherche d’une « signature cytologique » spécifiquement associée au sepsis : une quête du graal conceptuellement (in)appropriée ?

Question évaluée et objectifs de l’étude

La démarche expérimentale des auteurs est d’utiliser le single-cell RNA seq (séquençage du transcriptome de cellules uniques) sur des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) pour identifier, sans a priori, une signature cellulaire spécifique témoignant de la dérégulation immunitaire associée au sepsis bactérien.

Type d’étude

Analyse ex-vivo du transcriptome des leucocytes mononuclés humains (single-cell RNA seq).

Analyse bio-informatique visant à identifier des profils cellulaires spécifiques de sepsis.

Population étudiée

• Une cohorte de sujets sains (groupe contrôle, n=19)
• Une cohorte de patients avec infection urinaire aux urgences <12h :
• Un groupe de patients avec une infection urinaire non compliquée (UTI, n=10)
• Un groupe de patients avec une infection urinaire basse compliquée de dysfonction d’organe modérée ou transitoire (Int-Uro, n=7)
• Un groupe de patients avec une infection urinaire basse compliquée de dysfonction d’organe persistante (Urosepsis, n=10)
• Une cohorte de patients bactériémiques hospitalisés en “salle” >24h (BAC-SEP, n=4)
• Une cohorte de patients hospitalisés en réanimation >24h ;
• Pour choc septique (ICU-SEP, n=8)
• Pour une autre raison qu’un choc septique (ICU-NoSEP, n=7)

Méthode principale utilisée

Séquençage des ARNm sur cellules uniques (single-cell RNA seq) à partir de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC)

Également appelé séquençage aléatoire du transcriptome entier, le single-cell RNA seq est une technologie qui utilise le séquençage à haut débit (next-generation sequencing) pour identifier et quantifier l’ARNm présent dans une cellule unique à un instant donné.

Alors que toutes nos cellules ont le même ADN, elles se différencient par l’expression des gènes : c’est le transcriptome qui est responsable du phénotype cellulaire et donc de sa fonction. Brièvement, grâce à un circuit de micro-fluidique on peut isoler chaque cellule dans une gouttelette contenant des réactifs (polymérase, oligonucléotides, retrotranscriptase…) et une bille contenant un code-barre unique. Les cellules sont ensuite lysées, l’ensemble des ARNms capturés et convertis par retrotranscription en ADN complémentaire (ADNc). L’ADNc est alors amplifié et puis séquencé pour obtenir une « librairie ». Les variations au sein de cette librairie permettent de classer les cellules en fonction de leur transcriptome qui détermine le type cellulaire et l’état d’activation. Les auteurs présentent ici la matrice d’expression dans un graphique en réalisant une analyse en composantes principale (T-SNE) où, plus les cellules sont proches plus elles sont similaires. On peut ensuite comparer cette librairie a un transcriptome de référence, permettant par analyse bio-informatique de déterminer si les transcrits sont plus ou moins abondants par rapport à la condition contrôle.

Résultats essentiels

• L’analyse comparée des patients septiques versus non septiques permet aux auteurs d’identifier des états d’activation spécifiques concernant tous les types cellulaires étudiés surreprésentés chez les patients septiques : 3 états d’activation distincts pour les lymphocytes T, les lymphocytes B et les cellules dendritiques, 2 pour les NK et 4 pour les monocytes.
• Parmi ces 4 populations de monocytes, une est surreprésentée en proportion chez les patients septiques et chez les patients en ICU non-septiques. Cette sous-population (appelée MS1) exprime fortement le récepteur de l’interleukine 1, la resistin et l’enzyme ALOX5-AP impliquée dans la synthèse des leucotriènes.
• Les auteurs ont ensuite comparé cette fraction MS1 entre les chocs septiques et les patients de réanimation non septiques et observés que les patients septiques avaient une signature spécifique sur-exprimant de manière significative les gènes PLAC8 (survie cellulaire) et CLU (élimination des débris cellulaires et apoptose) au sein de la population MS1.
• En comparant ces marqueurs à d’autres tests diagnostiques de sepsis comme SeptiCyte® (test détectant le niveau d’expression des gènes CEACAM4, LAMP1, PLAC8, PLA2G7 dans le sang total) ¹ ou le FAIM3:PLAC8 Ratio ², les auteurs rapportent une supériorité de leur combinaison de marqueurs (abondance de la population MS1 et intensité d’expression de PLAC8 et CLU de la population MS1 ) pour le diagnostic sepsis Vs sain (AUC 0.92) et sepsis Vs inflammation (AUC 0.85).
• Par analyse de cytométrie en flux, les auteurs décrivent que cette signature transcriptomique caractéristique de la population MS1 (« sur-transcription » de PLAC8 et CLU) correspond sur le plan phénotypique à une population de monocytes exprimant faiblement le HLA-DR et fortement le récepteur de l’Iinterleukine-1 (CD14+, IL1R2hiHLA-DRlo). Cette population de monocytes peut être obtenue ex vivo en stimulant des précurseurs myéloïdes provenant de la moelle par LPS (agoniste de TLR4) ou P3C (agoniste de TLR2). Ce sous-type cellulaire peut ainsi être considéré comme un sous-type de cellules myéloïdes suppressives ou Monocytic Myeloid-Derived Suppressive Cells (Mo-MDSCs).
• La re-stimulation ex-vivo de ce sous-type de Mo-MDSCs (CD14+, IL1R2hiHLA-DRlo) par des agonistes TLR, provoque une production atténuée de cytokines pro-inflammatoires reflétant, selon les auteurs, une altération de la réponse immune.

Points forts

• Cette étude est la première à réaliser une analyse single-cell RNA seq en comparant des patients sains, infectés sans sepsis (infection urinaire non compliquée), sepsis, choc septique et en admis réanimation sans sepsis.
• Les auteurs concluent avoir identifié une signature cellulaire transcriptomique associée au sepsis avec des performances diagnostiques très bonnes, significativement supérieures en comparaison aux marqueurs jusqu’à présent publiés.
• Cette signature transcriptomique correspond à une nouvelle population de Mo-MDSCs facilement identifiable par cytométrie en flux (CD14+IL1R2^hiHLA-DR^lo). La détection de cette population cellulaire pourrait être un nouveau biomarqueur sensible et spécifique pour le diagnostic de sepsis.

Points faibles

Les outils de screening haut débit sont l’une des révolutions biotechnologiques les plus attrayantes de ces dernières années. Néanmoins, pour être pertinente leur utilisation doit être rigoureuse et l’interprétation des résultats mise en perspective avec la réalité clinique. Les arguments suivants expliquent pourquoi les conclusions de cet article sont probablement biaisées et probablement futiles pour les cliniciens :

• Malgré la volonté des auteurs de former des groupes homogènes, et alors même que le nombre de patients inclus par groupe est limité, les auteurs ont inclus une proportion importante de patients immuno-déprimés (y compris ayant reçu une chimiothérapie myéloablative récente) et de patients cancéreux, ce qui même sans sepsis modifie drastiquement le phénotype des Mo-MDSCs ³ (biais d’inclusion).
• 50% du groupe Bac-SEP ont un score SOFA <2 et par conséquent ne peuvent pas répondre à la définition actuelle du sepsis⁴ (biais de classement).
• L’inclusion de cas de sepsis sans infections bactérienne prouvée, à Gram-positif et à Gram-négatif, est un biais significatif pour une telle analyse. En effet, les voies de signalisation enclenchées sont différentes selon le type de germe⁵ (biais de recrutement).
• Enfin, avant même toute analyse, le choix d’analyser un temps unique, sans tenir compte des différences de délais entre le début de la maladie et l’inclusion selon les groupes, reflètent une conception erronée des mécanismes immunologiques associés au sepsis ⁶ (biais méthodologique).

Enfin on peut questionner la pertinence réelle de la conclusion des auteurs. En ce qui concerne le principal résultat de l’étude, à savoir l’identification de la population MS1, il semble peu probable qu’une différence de 0,1 à 0,2% des PBMC (sans différence en nombre absolu) ait une influence significative sur la physiopathologie ou le pronostic d’un sepsis. En effet, le nombre absolu de monocytes et leur pourcentage parmi les leucocytes varient respectivement de 1 à 1300/μl et de 1 à 10% des leucocytes dans les grandes cohortes de sepsis (ce qui correspond à une différence estimée d’environ 0,01 à 0,1% des leucocytes circulants pour le sous-ensemble MS1) ^7,8.

Commentaires et conclusion

La disponibilité d’outils de criblage à haut-débit couplés à des analyses bio-informatiques sans hypothèse a priori permettant d’identifier des multiples cibles avec une puissance statistique élevée, est une opportunité inestimable pour la recherche biomédicale. Néanmoins, ces stratégies de testing massifs ont a priori un «True to Not-True Relationships Ratio» très faible ^9,10. Aussi, l’application de ces techniques à des situations cliniques hétérogènes et complexes mérite une sélection irréprochable de sujets et probablement de multiples timepoint. En effet, le sepsis n’est pas une maladie spécifique mais bien un syndrome, dont la définition régulièrement revue et mise à jour ^11,12, est établie principalement pour des raisons épidémiologiques, de sensibilisation du public et le tri des patients par des professionnels de la santé. D’un point de vu biologique, il englobe des mécanismes complexes, disparates et dynamiques. C’est pourquoi il semble conceptuellement inapproprié de prétendre avoir trouvé dans ce travail, une « signature cytologique associée à la maladie sepsis ».

CONFLIT D'INTÉRÊTS

Commenté par Jérémie Joffre, Department of Anesthesia and Periopreative Care de l’UCSF School of Medicine de San Francisco, pour la Commission de la Recherche Translationnelle (CRT).

L’auteur déclare ne pas avoir de liens d’intérêt en rapport avec cette REACTU.

Le contenu des fiches REACTU traduit la position de leurs auteurs, mais n’engage ni la CERC ni la SRLF.
Envoyez vos commentaires/réactions à l’auteure (jeremie.joffre@inserm.fr) ou à la CERC.

LIENS UTILES

1. Miller, R.R., 3rd, et al. Validation of a Host Response Assay, SeptiCyte LAB, for Discriminating Sepsis from Systemic Inflammatory Response Syndrome in the ICU. Am J Respir Crit Care Med 198, 903-913 (2018).
2. Scicluna, B.P., et al. A molecular biomarker to diagnose community-acquired pneumonia on intensive care unit admission. Am J Respir Crit Care Med 192, 826-835 (2015).
3. Veglia, F., Perego, M. & Gabrilovich, D. Myeloid-derived suppressor cells coming of age. Nat Immunol 19, 108-119 (2018).
4. Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA 315, 801-810 (2016).
5. Feezor, R.J., et al. Molecular characterization of the acute inflammatory response to infections with gram-negative versus gram-positive bacteria. Infect Immun 71, 5803-5813 (2003).
6. Brudecki, L., Ferguson, D.A., McCall, C.E. & El Gazzar, M. Myeloid-derived suppressor cells evolve during sepsis and can enhance or attenuate the systemic inflammatory response. Infect Immun 80, 2026-2034 (2012).
7. Chung, H., Lee, J.H., Jo, Y.H., Hwang, J.E. & Kim, J. Circulating Monocyte Counts and its Impact on Outcomes in Patients With Severe Sepsis Including Septic Shock. Shock 51, 423-429 (2019).
8. Fang, W.F., et al. Incorporation of dynamic segmented neutrophil-to-monocyte ratio with leukocyte count for sepsis risk stratification. Sci Rep 9, 19756 (2019).
9. Ioannidis, J.P. Why most published research findings are false. PLoS Med 2, e124 (2005).
10. Young, N.S., Ioannidis, J.P. & Al-Ubaydli, O. Why current publication practices may distort science. PLoS Med 5, e201 (2008).
11. Bone, R.C., Sprung, C.L. & Sibbald, W.J. Definitions for sepsis and organ failure. Crit Care Med 20, 724-726 (1992).
12. Levy, M.M., et al. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference. Intensive Care Med 29, 530-538 (2003).

CERC

JB. LASCARROU (Secrétaire)
K. BACHOUMAS
SD. BARBAR
G. DECORMEILLE
N. HEMING
B. HERMANN
G. JACQ
T. KAMEL
JF. LLITJOS
L. OUANES-BESBES
G. PITON
L. POIROUX